В прошлом году было опубликовано множество научных статей по медицине – а именно, если верить базе данных Национального центра биотехнологической информации США, более пяти миллионов.

Конечно, уследить за всеми невозможно, но мы хотим рассказать о двух исследованиях, которые впечатлили нас больше всего и открывают широкие перспективы для медицинской науки в будущем.

CRISPR-Cas9 и РНК

иллюстрация — источник geneticliteracyproject.org

Предыстория. Омиксные технологии* — это очень популярное направление для исследований, в нём регулярно обнаруживаются новые возможности для коммерциализации и применения в медицине. Так, например, существуют большие надежды на успех клинических испытаний терапии с CRISPR-Cas9 при некоторых онкологических и наследственных патологиях.

*это неологизм, обозначающий направления исследований в биомедицинских науках, которые стали активно развиваться вследствие успеха проекта «Геном человека». Эти направления изучают последовательность, функцию и эволюцию всех генов (геномика), РНК (транскриптомика) или белков (протеомика) клетки, культуры клеток или целого организма. Термин «омиксные технологии» начал применяться, поскольку -омик стало слишком много. Помимо указанных, существует еще, по меньшей мере, десяток различных направлений.

Что это вообще такое? CRISPR — это часть ДНК бактерий и архей (безъядерных одноклеточных) – своего рода библиотека генетического материала, где роль книг выполняют фрагменты генов тех вирусов, атаку которых клеткам удалось пережить. Да, бактерии тоже страдают от вирусных «заболеваний».

В случае, если подобный вирус когда-нибудь ещё попытается атаковать бактерию, из этой библиотеки будет считана небольшая молекула РНК, которая будет прикрепляться к уже знакомой последовательности вирусной ДНК. После этого появляется «белок-убийца» Cas9, наносит разрез ДНК вируса – и тот больше не может размножаться внутри бактерии.

В ходе исследований с 1987 по 2005 год стало понятно, что CRISPR-Cas9 — это сложная система, выполняющую функцию «иммунного надзора» в клетках бактерий и архей.

И что с этим делать? В 2014-2015 годах было показано, что CRISPR-Cas9 можно использовать для генной инженерии, если «нацелить» систему на ген, который нужно повредить, и вставить вместо этого другую последовательность.

Многие исследователи идут по этому пути, но есть также и другой подход. Сам по себе поврежденный ген, даже если его мутация является патогенной, не наносит вреда клетке. К проявлениям заболевания приводят продукты его деятельности (или бездеятельности).

ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) — это большие молекулы, и, чтобы реализовывать свою генетическую информацию, с нужных генов считываются маленькие молекулы РНК (рибонуклеиновый кислоты). Из них вырезаются некоторые участки (сплайсинг) и далее с их последовательности считывается последовательность аминокислот, которые, соединяясь и сворачиваясь, образуют белок. Все эти процессы вместе определяют, какие функции будет выполнять клетка. И на любом из этапов могут возникнуть нарушения.

По данным литературы, до 15% генетически обусловленных заболеваний могут сопровождаться ошибками сплайсинга. Один из примеров — фронтотемпоральная деменция. Из-за мутаций в гене MAPT происходят ошибки сплайсинга РНК. На таких РНК возможен синтез патологических белков, в данном примере — белка тау.

В норме этот белок поддерживает цитоскелет нейронов, участвует в их делении и транспорте веществ. Помимо невыполнения своих функций, при мутации патологический белок тау будет скапливаться в клетках, связываясь в клубки, что приведёт к гибели пораженных нейронов и развитию когнитивных нарушений – памяти, речи, познавательных функций. Пока что нет известных способов лечения этого заболевания.

Что сделали исследователи. Сотрудники Института Солка (Калифорния, США) открыли новую модификацию CRISPR/Cas9, использовав вместо Cas9 белок Cas13d, выделенный из бактерий Ruminococcus flavefaciens [1].

Особенность этой модификации в том, что она будет делать разрез не в последовательности ДНК, а в последовательности РНК. Исследователи определили оптимальные условия для функционирования Cas13d и перешли к экспериментам с культурами клеток.

Было обнаружено, что новая система способна прицельно инактивировать (>90% от количества) те РНК, в которых есть ошибки сплайсинга, поскольку их физико-химические особенности отличаются от РНК без таких ошибок. В своих выводах ученые отмечают, что эта система может быть «нацелена» на любые РНК. Потенциально это может предотвратить гибель пораженных клеток.

Как это может повлиять на нас. Сегодня рано говорить о том, что проблема фронтотемпоральной деменции побеждена, или что мы хотя бы значительно приблизились к её разрешению.

Эта публикация — экспериментальная работа, показавшая, что при помощи CRISPR/Cas возможно влиять не только на ДНК, но ещё и на РНК. От этапа с клеточными культурами до начала клинических испытаний могут пройти годы, однако в случае успеха это может быть первой специфической терапией такого заболевания.

К сожалению, при использовании такого метода не исчезает основная проблема: мутации в гене MAPT . То есть, если прекратить влиять на продукты этого гена, то, со временем, в клетке снова образуется большое количество патологических РНК и патологических белков. Вполне возможно, что такая терапия, если будет доказана её безопасность и эффективность, потребует от больных постоянного приёма. Неясны вопросы цены и возможных побочных эффектов. Тем не менее, похоже, что в ближайшие месяцы и годы будет появляться всё больше и больше исследований с этим методом.

Теиксобактин — антибиотик нового класса

Предыстория. Войны бактерий — возможно, одни из самых ранних конфликтов, которые происходили на Земле. В условиях ограниченных ресурсов им приходилось учиться находить новые источники энергии и сражаться с другими видами бактерий, которые делали то же самое. Сегодня человек научился использовать оружие бактерий против их самих, но не слишком успешно.

Эволюция бактерий и устойчивость к антибиотикам. 

Видео предоставлено Гарвардской медицинской школы. В эксперименте исследователи разделили огромную поверхность на зоны, куда наносили антибиотик. В крайних боковых делениях он отсутствует, начиная со второго деления и до центрального концентрация возрастает тысячекратно. На видеозаписи эксперимента видно, что бактерии смогли выработать устойчивость и размножаться даже при тысячекратной концентрации антибиотика.

Генетический материал бактерий — это большая молекула ДНК, находящаяся в их цитоплазме. В ней содержатся гены, которые обеспечивают все процессы жизнедеятельности микроорганизма. Помимо этой молекулы, в бактериальной клетке встречаются маленькие участки ДНК, плазмиды. Одна из их разновидностей, R-плазмида, обеспечивает бактерию устойчивостью к антибиотикам.

Есть разные механизмы формирования бактериальной устойчивости: в одних случаях такие плазмиды кодируют ферменты, которые инактивируют антибиотики, в других — воздействуют на собственные органеллы, чтобы помешать действию антибиотиков. Что хуже для нас: бактерии мутируют и умеют «делиться» R-плазмидами, так что если она появилась у одной бактерии в колонии, со временем вся колония может стать резистентной.

Устойчивость к антибиотикам признаётся ВОЗ одной из самых опасных проблем здравоохранения [2]. Из-за нерационального использования антибиотиков может возникнуть ситуация, когда возбудители рутинных инфекций будут устойчивы к имеющимся лекарствам, что повысит смертность.

Временная линия создания антибиотков. На схеме показано, что в последние десятилетия прогресс в создании новых антибиотиков замедлился. Источник: antibioticresearch.org.uk

К сожалению, пока что мы проигрываем «гонку вооружений» с бактериями, и тем ценнее исследования, которые предлагают новые инструменты против устойчивых микроорганизмов.

Что сделали исследователи. В 2015-м году группа исследователей [3] определила новый вид антибиотика, назвав его теиксобактин. В 2018-м году была опубликована работа об успешном синтезе десяти его аналогов [4].

Если обратить внимание на графики со временем разработки разных групп антибиотиков, можно обнаружить «провал». Дело в том, что далеко не все бактерии дают рост колоний на стандартных питательных средах и, таким образом, многие из них оставались вне досягаемости для исследований. До недавних пор.

Исследователи, опубликовавшие работу в 2015-м году, разработали новый подход к выращиванию микроорганизмов, назвав его iChip10. Суть его заключается в попытке воссоздать естественные условия обитаний для бактерий: используется почва, в которой они размножаются, и факторы роста, которые стимулируют бактерий делиться. Был обнаружен новый вид бактерий, Eleftheria terrae, из культуры которого получили экстракт с будущим антибиотиком.

В исследованиях с другими микроорганизмами выяснилось, что тексобактин воздействует на бактерий с определённым строением мембраны. А самое удивительное то, что устойчивости к нему не было обнаружено даже при попытках её вызвать у Mycobacterium tuberculosis, возбудителя туберкулеза, и у метициллиин-устойчивого Staphylococcus aureus – бактерий, которые характеризуются быстрым формированием резистентности и вызывающих инфекционные заболевания у людей.

В 2018-м исследователи добились приемлемых физико-химических свойств вещества, создали десять аналогов и провели испытания на мышах с вызванным инфекционным кератитом. Теиксобактин успешно справлялся с возбудителем.

Как это может повлиять на нас. Успехи прошлого года могут значить, что совсем скоро начнутся клинические испытания. Компания планирует начать I фазу клинических испытаний в 2019 году, если Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США даст на это одобрение.

При этом нельзя исключать, что гипотетически формирование устойчивости к теиксобактину возможно: ранее уже бывали случаи, когда в лаборатории устойчивость почти не формировалась, однако была обнаружена на больших выборках пациентов.

К сожалению, ни один препарат не решит глобальную проблему безответственного приема антибиотиков. До тех пор, пока антибиотики в Украине возможно купить без рецепта врача, мы находимся в группе риска по формированию устойчивых патогенных бактерий. Помните, что со временем эффективных способов борьбы с патогенными бактериями становится всё меньше и лучший способ это исправить — ответственно относиться к своему здоровью.

Текст: Александр Петренко

Источники:

1. Konermann, Silvana, Peter Lotfy, Nicholas J. Brideau, Jennifer Oki, Maxim N. Shokhirev, и Patrick D. Hsu. «Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors». Cell 173, vol. 3: 665-676.e14. 
2. «ВОЗ | Устойчивость к антибиотикам». Просмотрено 26 декабрь 2018 г.
3. «A new antibiotic kills pathogens without detectable resistance | Nature».
4. Parmar, Anish, Rajamani Lakshminarayanan, Abhishek Iyer, Venkatesh Mayandi, Eunice Tze Leng Goh, Daniel G. Lloyd, Madhavi Latha S. Chalasani, и др. «Design and Syntheses of Highly Potent Teixobactin Analogues against Staphylococcus aureus, Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA), and Vancomycin-Resistant Enterococci (VRE) in Vitro and in Vivo». Journal of Medicinal Chemistry 61, vol. 5: 2009–17.